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    熒光定量pcr儀工作原理

    更新時間:2019-08-22瀏覽:3055次

    將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后,完成高溫變性,低溫復性,適溫延伸的熱循環,并遵守聚合酶鏈反應規律,與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷,熒光素游離于反應體系中,在特定光激發下發出熒光,隨著循環次數的增加,被擴增的目的基因片段呈指數規律增長,通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度,求得Ct值,同時利用數個已知模板濃度的標準品作對照,即可得出待測標本目的基因的拷貝數。

      Ct值(Cyclethreshold,循環閾值)的含義為:每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。

      1. 熒光閾值(threshold)的設定

      PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號,熒光閾值的缺省(默認)設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍,即:threshold= 10*SDcycle 3-15

      2. Ct值與起始模板的關系

      每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系,公式如下。

      Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

      n為擴增反應的循環次數,X0為初始模板量,Ex為擴增效率,N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量。

      起始拷貝數越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數的對數,縱坐標代Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

     

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